人调节T细胞PanelCD45,CD3,CD4,CD25,CD127

样本收集

      1.血浆处理：将全血采集至含EDTA抗凝剂的采血管中，上下轻轻颠倒混匀。30min中内，4℃下3000g离心20min，收集上清。

      2.血清处理：将全血采集至不含抗凝剂的采血管中，室温放置30min或4℃放置2h。4℃下3000g离心20min，收集上清。

      3.细胞裂解液：收集细胞后加入PBS，400g离心5min，弃去上清，加入适量裂解液（ 10^7细胞对应加入200μl 裂解液），4℃放置 20min，4℃下13000g离心 10min，取上清。

      4.细胞培养上清：收集细胞培养后的培养基，4℃下3000g离心 10min，取上清。

自备材料

      1.流式细胞仪

      2. 移液器

      3. 振荡器

      4. 纯水仪

注意事项

      1.试剂盒应保存于2-8℃，使用前请将试剂盒室温平衡30min；

      2.标准品重溶后若一次用不完，应分装放于-80℃保存，以防止降解；

      3.荧光易淬灭，注意避光反应；

      4.所有试剂应使用前混匀；

试剂盒主要组分

试剂准备

              标准品准备：标准品为冻干粉，加入200μl Standard diluet ，冰上放置20min，使其充分溶解，使用前涡旋混匀即为S1(10000pg/ml)，另取7支EP管标记S2-S7、最后一管为空白管，每管加入150μl Standard diluet ，依次做4倍稀释至S7，空白管为Standard diluet 。

样本前处理：对于超出检测线性范围的细胞因子高浓度血清样本，用样本稀释液适当稀释。

Beads：微球使用前涡旋混匀15s，用Assay Buffer 9：1稀释至1×；

检测抗体：用Assay Buffer 9：1稀释至1×，涡旋混匀；

SA-PE：用1×Wash Buffer稀释至1×；

操作步骤

96孔板：

（1）Beads：取25μl/孔稀释后的Beads溶液加到对应孔中，

（2）标准品和样本：按照实验排布加入25μl的标准品和样本，室温下摇床850rpm避光孵育2h；

（3）洗板：孵育结束后将微孔板放置于磁力架上2min，每孔加入100μl Wash Buffer，置于磁力架上2min，弃上清，重复三次；

（4）检测抗体：每孔加入50μl检测抗体，室温下摇床850rpm避光孵育1h；

（5）洗板：孵育结束后将微孔板放置于磁力架上2min，每孔加入100μl Wash Buffer，置于磁力架上2min，弃上清，重复三次；

（6）SA-PE：每孔加入50μlSA-PE，锡纸膜封板，室温下摇床850rpm避光孵育30min；

（7）洗板：孵育结束后将微孔板放置于磁力架上2min，每孔加入100μl Wash Buffer，置于磁力架上2min，弃上清，重复三次；

    （8）上机：每孔加入100μl wash buffer，室温下摇床（800±50）避光孵育1min，流式细胞仪上机检测。

结果分析

标准曲线应浓度为横坐标，荧光值为纵坐标，绘制四参数拟合方程，以计算样本浓度。

试剂盒性能数据：

1.准确性：标准曲线回归方程R²≥0.9900；

2.检测范围：10000-2.44pg/ml；

3.灵敏度：

4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%；

 5.有效期：1年

免责声明

1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床诊断，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。