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上次我们说到流式实验对照设置，这次我们要说到染色和上机了。染色和上机不仅是一项技术活，更像是一门艺术。它要求我们在细节中追求卓越，在操作中体现精准。每一个步骤，无论是细胞的准备、染料的选择，还是染色时间的控制，都需要我们用心去把握，才能呈现出最完美的效果。

话不多说，我们直接上干货！

细胞染色

  细胞表面染色

  1.取细胞样本或全血样本，加入适量表面抗体，室温避光孵育；

  2.洗涤细胞以去除未结合的抗体，通常使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行洗涤。

 （在某些情况下，可能需要裂解红细胞以避免对稀有细胞分析的干扰。）

  3.重悬细胞，准备上机检测。

  胞内因子染色

 （常见：胞内因子，例如IL-4等；核内抗原，例如FOXP3；胞内抗原）

  1.首先进行表面抗体染色，然后固定细胞以稳定抗原；

  2.使用破膜剂处理细胞，使胞内抗原暴露；

  3.加入胞内抗体，室温避光孵育；

  4.洗涤细胞以去除未结合的抗体；

  5.重悬细胞，准备上机检测。

   上机检测

  设置和调整

1. 选择合适的波长：根据荧光标记物的特性和激发波长选择适当的波长；
2. 设置阈值：根据样品中荧光信号强度设置阈值，在此范围内收集数据；
3. 调整参数：根据实验要求调整相关参数，如放大倍数、增益等。

  数据分析

  常用的方法有直方图、双参数图、多参数分析

         直方图：便于观察样品中目标分子的表达情况

    双参数图：将两种荧光标记物的信号强度绘制在同一张图上，以便于观察它们之间的关系。

 注意事项

1. 样品处理要彻底：样品处理不彻底会导致细胞聚集、死亡等问题，影响数据质量和准确性。

2. 荧光标记物选择要合理：荧光标记物选择不合理会影响数据质量和准确性。

3. 流式仪器操作要规范：流式仪器操作不规范会影响数据质量和准确性。

4. 数据分析要准确：数据分析不准确会影响结果判断和结论推断。